【摘要】

目的

【关键词】 骨髓干细胞移植；移植，自体；肝硬化

     失代偿期肝硬化是各种肝纤维化疾病的终末期，其特征性的表现为肝结构紊乱及假肝小叶形成。原位肝移植(orthotopic liver transplantationOLT)是终末期肝硬化患者最有效的治疗方法，但OLT仍有较大局限性，受到器官供体缺乏、治疗费用高昂和并发症多等原因的限制。据资料显示，在每年需要行肝移植的肝硬化患者中，能获得移植手术治疗的患者不到10%,而绝大多数患者死于肝硬化终末期的病理进程。因此，临床上寻找一种有效的替代治疗手段十分必要。

     近几年来，细胞生物学技术的发展使骨髓干细胞（bone marrow stem cell, BMSC）及祖细胞的分离和鉴定有了很大的进步，这给我们治疗遗传性和慢性肝病带来新的思路。在人骨髓中至少存在两种干细胞，包括间充质干细胞和造血干细胞。研究证明，通过注入BMSC,可以逆转肝纤维化过 程，而且干细胞可以在体内转化成功能性肝细胞。

     我们釆用患者自体骨髓源性干细胞作为供体，并在体外进行分离纯化，再经肝动脉途径移植入患者肝内，使干细胞在肝脏中分化生长为具有功能的肝细胞，使肝硬化患者的肝功能得到效果明显的恢复和重建。

对象和方法

     1.病例选择：收集2007年5月一2008年12月在沈阳军区总医院消化科住院的78例失代偿 期肝硬化患者，年龄26〜67岁，其中女性29例， 男性49例，中位年龄51岁。78例患者中肝炎肝 硬化56例，酒精性肝硬化21例，血吸虫性肝硬化 1 例；肝功能 Child-TurcottLPugh（CTP）分级 B 级29例,C级49例。所有78例患者术前均存在 肝硬化常见症状和体征，包括纳差、乏力、腹胀，同时经腹部B超或腹部CT检査均明确肝硬化诊 断,排除肝脏恶性肿瘤。术前实验室检査包括血 清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、 总胆红素（TBIL）、血浆白蛋白（ALB）、凝血酶原 时间（PT）和纤维蛋白原（FIB）,部分患者还进行 了血氨、甲胎蛋白及血脂检测。患者入院后根据 病情予对症治疗，如部分重度腹水、下肢浮肿者， 给予利尿及腹水回输，症状改善后，内科停止治 疗,进行干细胞移植术前准备。治疗前患者签署 知情同意书。

     2.术前准备：术前给予粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员BMSC,每天1次皮下注射 4 ug/kg,连续2d；术前1d行碘过敏试验、双侧腹 股沟备皮，术前4 h禁食、水,移植当天对患者进行 隔离,骨髓穿刺术前5〜10 h进行房间消毒。

     3.BMSC采集及分离：取右侧骼后上棘为穿 刺点，局部麻醉消毒,在无菌条件下，以18号骨髓 穿刺针穿刺，抽取骨髓180〜200 ml,以7500 U肝素抗凝，然后采用负筛选法进行BMSC的体外分离及纯化，获取单个核细胞计数3.6X10^8/ml~1.8X10^11/ml,釆用流式细胞仪检测CD34+干细胞数为10^6/ml~10^9/ml,4 C冰箱保存，时间不超过3h。

     4.移植方法：在数字减影血管造影下经股动 脉穿刺插管，置管于肝固有动脉并造影，观察肝内 血管情况及有无占位性病变。将待用的细胞悬液 于3 h内分别经左、右肝动脉缓慢注入，术毕拔管，穿 刺点加压包扎后患者返回病房,术侧下肢制动6h。

     5.疗效观察：术后观察指标包括患者临床症 状3项、体征2项，实验室指标6项及CTP分级、 分数变化。术后2,4,8周分别复査ALT、AST、 TBIL,PT、FIB及血浆ALB等指标。根据脩床症 状、体征和实验室检查结果及CTP分数,将疗效 分为显效（临床症状、体征有3项以上好转，实验 室指标有3项以上改善,CTP分数提高3分以上）、有效（临床症状、体征至少有1项好转，实验 室检査指标至少有2项改善）、无效（临床症状和 体征无改善，实验室检查指标无好转）

     6.统计学方法：移植前、后实验室数据以均数士标准差（x拔 ± s）表示，同一患者治疗前、后比较 釆用配对t检验,F＜0. 05为差异有统计学意义。

结果

     1.实验室指标改变：在干细胞移植后第2周 实验室指标开始出现变化，至第4周多项指标出 现显著变化，其中血清ALB较术前明显升高，转 氨酶下降，PT明显下降，FIB明显升高，见表1。提示移植前、后肝功能有显著改善，凝血机制亦有 显著改善。但移植前、后TBIL水平变化差异无统 计学意义（P>0. 05）。

     2.临床症状及体征：自体BMSC移植后第4 周开始，大多数患者临床症状和体征有明显改善， 其中腹水减少或消失及下肢浮肿减轻70例 （89.7%）,食欲改善、体力好转72例（92.3%）,腹 胀减轻68例（87.2%）。

     3.CTP评分变化：移植前CTP B级患者的评分为8. 86 + 0.35, C级患者为12. 10±1.16,至移植第2、4、8周时，B级患者CTP评分分别 为7. 93士0.91、7. 24+0. 94和肝硬化是临床常见6.31+0. 75, C 级患者分别为 11.86±1.09、 10. 88±1. 22 和 10. 67 + 1. 32,均逐渐下降。

     4.不良反应：78例患者移植后除因上消化道 出血死亡3例外，近期无严重不良反应，亦未发现 与干细胞移植相关的并发症。术后低热及轻度恶心各1例,24 h自行缓解。无明显感染症状、肝区疼痛、出血等并发症。

讨论

     疾病，补充足够的肝细胞、控制肝纤维化的进展甚至逆转纤维化过程，是目前及未来肝硬化治 疗的热点。BMSC是目前备受关注的一种供体细胞，易釆集并可在体外大量扩增⑺、可自我更新并向多种类型细胞转化、体积小易进入肝实质、可自体移植而无免疫排斥反应、无伦理道德问题等优点。目前，国内、外通过BMSC移植治疗肝硬化的临床研究日益增多，其对肝硬化的治疗作用主要有两个方面，一是促进肝细胞再生，二是控制肝纤维组织形成。

     BMSC促进肝细胞再生的机制已有大量的相关研究。动物实验研究显示，肝硬化小鼠在 BMSC移植后，脂类代谢激活,血清载脂蛋白a、载脂蛋白c3、维生素D结合蛋白等水平升高，肝内微环境的改变可促进BMSC的转化，其转化与肝损 伤的类型及程度有关，肝纤维化与肝硬化所致的 慢性肝损伤更适于采取BMSC移植的方法达到治 疗目的。

     另外，损伤肝细胞可产生某种信号作用于BMSC,使其分泌肝细胞生长因子(HGF)至细胞外，而HGF可促进BMSC分化,且具有抗细胞 凋亡活性，在纤维化肝脏的再生中起重要作用。研究表明，将BMSC注入经G-CSF预处理的慢性 肝损伤小鼠模型体内，发现种植于受体肝脏的外源性BMSC很少，但受体自身的肝细胞增殖较明 显，肝损伤恢复较迅速，原因为G-CSF与局部微 环境相互作用，动员自身造血干细胞向受损肝脏 归巢，促进内源性肝细胞的增殖。

     BMSC可以通过多种不同的方式抑制肝组织 纤维化形成。许多研究发'现，种植于肝脏的BMSC通过旁分泌形式分泌多种细胞因子和生长 因子，如白细胞介素(ID-10,肿瘤坏死因子 (TNF)-a、HGF和神经生长因子等，它们在促进 肝脏再生和修复的同时，抑制肝脏炎性反应、促进 细胞外基质(ECM)降解、改善凋亡诱导的肝损伤、 提高血清白蛋白水平。另外，BMSC可影响肝星状细胞，或通过诱导凋亡减少其数量，或通过减少转化生长因子(TGF)-pl的分泌抑制肝星状细胞 的激活，从而减少ECM沉积，改善肝纤维化程度。

     为探索骨髓源性干细胞对肝硬化患者的治疗作用,我们在临床上开展了自体骨髓源性干细胞经肝动脉移植治疗失代偿期肝硬化的研究。本研究釆用患者自体BMSC作为供体，在体外分离纯化，经流式细胞仪检验并确定CD34+干细胞及其数量,然后移植入患者肝内，观察实验室各项指 标、临床症状、体征的恢复情况。

     我们的研究显示:

     ①移植后第2周实验室指标出现变化,至移植 后第4周，所有患者血清ALB水平均明显升高， 是生化指标中改善最显著的一项，其次是FIB水 平和PT,ALT,AST于术后第4周亦出现明显下降。

     ②血清TBIL水平虽有下降，但差异无统计学意义。考虑可能原因是肝硬化时肝细胞损害和肝小叶结构破坏，导致结合胆红素不能正常排入细小胆管而反流入血。BMSC移植后短期内，上述肝硬化的病理损害未能修复，故血清胆红素无有效下降。

     本组资料还显示：

     ①血清ALB至第4周呈快速上升状态，至第8周上升速度减慢，有部分患者 甚至比第4周时低，但仍高于术前水平，分析原因 考虑干细胞移植入肝内定植后，在短期内即可分 化大量新生肝细胞，使血清ALB的合成明显提 高，推测干细胞向肝细胞分化的高峰期在第4周至第8周，之后分化水平下降，但仍可维持在一定 水平。我们在临床上已经开展了二次BMSC移 植，时间选在首次移植后的第3个月到半年内，发现可使患者肝功能指标进一步改善，因病例数及 相关数据还不完整，尚需进一步观察。

     ②CTP B 级患者的分数在术后下降幅度较大,C级患者术 后下降幅度较小，分析原因考虑BMSC移植后的疗效与术前病情的轻重程度有关。提示对肝硬化患者进行自体BMSC移植能有效控制临床症状进展。

     3例患者的死因均为上消化道大出血，术前胃镜检査显示食管静脉重度曲张，提示BMSC移植 短期内不能改善患者门静脉高压状态，中、长期效果尚需进一步临床观察。

     我国是肝病大国，各种原因导致的肝硬化患者众多。在目前国内中、晚期肝硬化内、外科治疗现状下，自体BMSC肝内移植是临床治疗手段的 重大进步和有益补充。除药物及OLT治疗之外，BMSC的自体移植给了患者一个新的选择。虽 然,BMSC移植尚不能治愈肝病，但可在很大程度 上控制肝硬化的进展速度，提高肝硬化患者的生存质量。